肿瘤基因分型快速发展，ctDNA临床有效性和实用性遭质疑？

数据显示ctDNA检测结果与肿瘤活检结果不一致，专家更支持对肿瘤样本进行基因分型的检测方法。同样，没有足够证据表明ctDNA检测能用于癌症早筛、治疗监测和预后检测。

专家还发现实验方法上，ctDNA来源最好是在细胞稳定管或EDTA管中收集的血浆样本，同时EDTA管应在采集血浆6小时内进行处理。

该联合评论由ASCO和美国病理学家协会成立的一个肿瘤学和病理学联合小组发表，遴选出1338篇文献，全文阅读390篇，并额外研究了31个有价值的文献数据，最终将77篇文章结果纳入该评论文章。

表一、相关术语的定义和解释

“液体活检”是10年前由Pantel和Alix-Panabiere提出，指通过血液检查，提供和组织活检相同的诊断信息。相比传统活检，液体活检更方便、对患者风险最小同时花费更少（如表二）因此能连续检测，提供实时完整的系列信息。理论上，对于患者肿瘤负荷的完整信息，液体活检也能提供更多。而对解刨部位的单个病灶进行采样所做的活检有空间限制，提供的信息也有限。液体活检包括可溶性因子测量，如蛋白质，肿瘤标志物（如癌胚抗原），循环肿瘤细胞和循环游离核酸等研究对象，该文章重点介绍游离DNA的技术成果和研究进展。

表二、ctDNA检测与肿瘤组织活检比较

表三、ctDNA检测在美国研究调查的结果汇总

专家从不同方面对ctDNA检测法进行评论：

最佳样本类型

证据表明，分析ctDNA的最佳标本类型是血浆。血清和血浆由全血中无细胞的液体组成。

它们的主要区别在于血清没有凝血因子。来自同一血液样本的细胞总游离DNA（正常和ctDNA）浓度，血清比血浆更高。血液中大多数游离DNA都是白细胞溶解产生的，但来自白细胞的正常DNA会稀释血浆中ctDNA浓度，尤其是抽血后很快分离白细胞或血液被收集在含有白细胞稳定剂的制备管中，都让血浆ctDNA浓度大为减少。

标本收集

抽血。大多数已发表的研究都很少论述抽血细节，通常会从外周静脉采集血液，目前还没有不同标本来源的数据比较（例如，中央静脉或直接来自血管内动脉等），其他影响抽血的因素（如重复使用收集管、管填充多少、将管倒置或抽血顺序等）都未涉及。实际上，抽血者都应遵循管制造商的使用规范和说明来操作。

管类型和样品处理。血液采集管类型是最常被研究的预分析变量。标准的含有抗凝血剂K2EDTA的淡紫色管，适用于游离DNA的样本采集。关键点是应在6小时内尽快处理，避免白细胞溶解、避免白细胞DNA稀释目标ctDNA。若使用白细胞稳定管，时间可允许在48小时内或更长时间内进行处理。但至今关于不同收集管类型对实验影响的数据未见报道。

一旦收集到外周血，通常会过滤或在低速下连续离心，在EDTA管中收集的血液应在数小时内进行处理，并第一次注意低速离心以保证白细胞少溶解。如果不及时处理，比如冷藏储存3~5天，或加温到40℃都会导至白细胞裂解，造成实验误差。

其他影响因素还包括样本运输、DNA纯化、操作人素质差异、以及被抽血者的身体状况，吸烟、怀孕、运动、代谢综合征、自身免疫性疾病等众多数据都需要详细记录在案，并分析上述变量和实验结果的关系。

分析有效性

对于ctDNA分析有多种方法，如实时或数字PCR检测特定已知的基因变异，检测非小细胞肺癌的EGFR基因就是如此。另外一种方法是NGS测序法，能一次性在多个基因中检测更多基因变异，通常一下检测50个。值得注意地是，不同ctDNA检测结果可能并不相同，首先不同方法的检测下限不同，此外检测的目标基因组区域存在差异，所以不同检测手段不能互换，如果这样就必须进行严格的交叉分析和比较。

已发表的最常用评估方法是比较肿瘤和血浆中基因变异间的一致性，但很多生物学因素可能会影响一致性，如肿瘤类型、分期、分期、肿瘤组织和血液样本的取样时间、体克隆变异或亚克隆等。以上因素会混淆结果分析，分不清结果差异是分析造成还是生物因素所致。

解释和报告

除了不同ctDNA检测方法带来的差异，不同患者的ctDNA占游离DNA总量的比例都存在很大变化，需要谨慎解读。而且不同样本处理后的白细胞DNA含量也不尽相同。另外肿瘤的异质性表明有些变异并非存在于所有癌细胞中，这些变异的亚克隆对靶向治疗的反应程度就会较低，治疗效果就会打折扣。

另外并非所有游离DNA变异都来源癌细胞，有些很健康的人的体细胞也会有基因变异。还有研究发现人体一种获得性突变——克隆性造血作用，会增加罹患血液癌症的风险，这种克隆性造血现象与人年龄有关，年龄越大发病率越高，但目前并不能证明它一定会导至血癌发生，所以研究者在解释ctDNA突变时都要非常谨慎。

临床有效性和实用性

在临床有效性方面，目前，一个基于PCR的ctDNA法检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者的EGFR变异已获得美国和欧洲监管部门的批准。而且基于PCR法对NSCLC的EGFR进行ctDNA检测，以及结直肠癌的KRAS基因突变检测都已在欧洲实现商业化。这些ctDNA技术都已证明其临床有效性。

文献证明，ctDNA检测对癌症晚期病人治疗更有帮助，如果病人对之前治疗仍有反应时，或仍有疗效时就不适宜根据ctDNA检测调整治疗方案。

图一表示液体活检呈阴性的病人治疗方案选择，能看出目前液态活检的敏感性并不是非常理想，与癌症组织检测存在一定程度的差异，主要表现在，一是肿瘤组织检测中基因变异或不变异的情况下，液态活检无法给出准确结果，所以仅依靠ctDNA法可能并不正确。

图一、液体活检呈阴性的病人治疗方案

ctDNA检测的另一个潜在用途是监测治疗作用，定量测量随着时间的推移，患者ctDNA对癌症治疗的反应。但实际操作起来也具有挑战性，第一测量结果的兼容性和互操作性可能不同，因为不同实验室的检测可能不具有可比性，或定量结果不能重复。第二，量化DNA负荷的最佳单位尚未统一，目前大多数方法都是测量体细胞等位基因变异的比例，或每单位血浆体细胞变异数量，而前者需要保证每单位血浆的DNA数量要相同，但实际上，计算变异比例会受多种因素影响，如非癌症来源的游离DNA含量，该含量随时间波动并受某些疗法的影响，所以定量测量DNA的最佳方法目前还未建立。

结论

专家们也表示，未来ctDNA检测有望在患者治疗中发挥作用，尽管目前是研究热点，但在常规临床检测中仍需要临床实用证据。除了部分晚期癌症患者，以及获得监管部门批准的方法外，现在几乎没有临床有效性证据和临床实用程序，能广泛支持使用ctDNA检测法。但肿瘤基因分型在癌症治疗中是一个快速发展的领域，随着时间推移，可能出现足够证据以更好评估ctDNA检测的临床有效性和实用性。