液体活检领域，测序界“网红”NovaSeq红不起来

     加入了NovaSeq，Illumina 现有二代测序平台：MiSeq、HiSeq2500(1000G)、HiSeq3000、HiSeq4000、NextSeq500、HiSeqX10 (10台HiSeq2500并行)、HiSeq X Five、NovaSeq5000、NovaSeq6000。

重点！重点！重点！今天这篇文章不是要细数Illumina 现有二代测序平台，而是在液体活检领域HiSeq3000、HiSeq4000、HiSeqX10以及NovaSeq等二代测序平台的一个“BUG”。

     2017年4月份，illumina公布了题为“Effects of Index Misassignment on Multiplexing and Downstream Analysis”的白皮书[1]。坦诚了illumina一些高通量型号，如HiSeq 3000/4000，Hiseq X Series 及NovaSeq等仪器，容易出现样品标签错配（形象的理解为样本带错帽，就像下图的小黄人）的问题，而这些仪器的共同点在于，都采用了新型的以Nano-Well 为特点的Patterned Flow Cell Technology(PFCT)，簇生成方式也有别于传统的桥式PCR，换成了ExAmp(Exclusion Amplification，排他性扩增)。Illumina生动的描述这种现象为“标签跳跃”(index hopping)。

      比如在2017年初，美国Standford大学的科研工作者Sinha，利用illumina Hiseq 4000对RNA样本进行测序。结果，本以为自己找到了真正的造血干细胞，但难以重复的实验结果使他发现，那些“激动人心的结果”只不过是在 illumina ExAmp平台的交叉污染产生的“镜花水月”。而相同的文库用Nextseq 500进行测序，那些“激动人心的结果”也再也没来敲门[2]。无独有偶，Cambridge University和Swedish Bioinformatician等研究机构都发现了在Hiseq4000等型号上出现了类似的index标定到错误样品上的问题[2]。

       根据研究发现在低频突变检验、基因表达、微生物分析等多方面研究可能会受到标签错配的影响。

       采用NGS检测ctDNA现已成为替代侵入组织活检的“液体活检”，在极低频突变检测中，避免假阳性是液体活检从业者格外关心的重要一环，能够准确的从30亿对碱基中寻找到低频突变，更低的假阳性、更高的敏感度一直是追求的目标。

       而样本串扰发生时，NGS超深度测序优势却被样本错配拖累到不显著了，无法给予准确的后续临床指导用药基因检测结果。因此深究导至标签错配生成的背后原因和如何避免就显得尤为重要。

       读到这里，大家一定感叹，新技术的出现解决完现有问题，怎么又引入了新的问题。当然，标签错配的“锅”不能只让测序平台来背，接头或引物制备过程中污染、实验室污染，人为操作等、文库构建残留接头或PCR 引物、捕获平台样本多杂一，不完全匹配扩增，以及测序平台等均会导至标签错配。

       而测序平台作为NGS流程的最后一步，在前期环节均保持一致的情况下，还出现标签错配，那这个锅测序平台就必须得背着了。

      让我们再次回归到文章提到的Sinha的例子，在以传统桥式PCR作为簇生成方式的 non-PFCT型测序仪Nextseq 500重新测序后，交叉污染消失了。ExAmp这种技术搭配PFCT使用，大大提升了测序效率，降低了测序成本。但是与传统的桥式扩增相比，也引起了更多的样本错配，HiSeq3000、HiSeq4000、HiSeqX10以及新贵NovaSeq5000、NovaSeq6000都采用了ExAmp技术，标签跳跃的比例可高达到2%。而液体活检的突变频率要求低至0.1%，而这也导至了在低频突变检测上大大限制了NovaSe，Hiseq X系列等的应用。

       由于测序成本降低，在检测同等基因数的情况下，相比于NextSeq500平台市场价格能够下调较多，多家基因检测公司引入了HiSeq3000、HiSeq4000、HiSeqX10甚至NovaSeq5000、NovaSeq6000作为二代测序平台，在降低测序成本的同时，要多样本同时检测，必然会造成低频突变交叉污染，导至检测结果“张冠李戴”。

参考文献：