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免疫检测中的反应模式

2018-2-23 00:00| 编辑: 小桔灯网| 查看: 3364| 评论: 0|来源: KHB市场部 刘一阳

摘要: 在免疫检测中,即使相同的项目,也常常有不同的反应模式。这些模式各有特点,其中夹心法、竞争法可用于检测抗原,也可用于检测抗体;间接法、捕获法仅可用于检测抗体。下面为大家介绍各种反应模式的特点。夹心法夹心 ...

在免疫检测中,即使相同的项目,也常常有不同的反应模式。这些模式各有特点,其中夹心法、竞争法可用于检测抗原,也可用于检测抗体;间接法、捕获法仅可用于检测抗体。

下面为大家介绍各种反应模式的特点。


  • 夹心法

夹心法分为检测抗体的双抗原夹心法和检测抗原的双抗体夹心法。其中双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,可用于检测有两个及两个以上抗原决定簇的多价抗原,但无法检测小分子半抗原。

双抗体夹心法的基本原理是,将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体;加入待测样本,孵育使样本中的抗原与固相抗体充分反应,形成固相抗体-抗原复合物,之后洗涤除去其他未结合物;加入标记特异性抗体并孵育,使标记抗体与固相抗体-抗原复合物结合,形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物(双抗体夹心),洗涤除去未结合的标记抗体;最后根据不同的方法学,加入不同的反应物质(如酶促底物、碱性溶液、氧化剂等),得到反应信号;读取信号,根据预先设定的COV或标准曲线,进行定性或定量的结果判读[1]。过程如图1所示。

经典的夹心法均为两步法,即待测样本与标记抗体(或抗原)分两次加入反应体系,两次分别进行孵育和洗涤。

由于两次孵育和洗涤会延长反应时间且操作繁琐,在经典的夹心法基础上,发展了一步夹心法,即待测样本与标记抗体(或抗原)同时加入反应体系,共同进行孵育,之后共同洗涤。但一步夹心法可能带来钩状效应,高滴度样本可能出现假阴性结果,两步法可以避免这样的情况发生。

      双抗体夹心法易受干扰。常见的干扰物质包括[2]人抗动物抗体(HA)和类风湿因子(RF),可造成假阴性及假阳性结果。HA是人抗动物抗体,结合力较弱,可与来自不同物种的免疫球蛋白反应,这些物种包括小鼠、山羊、兔子、绵羊和鸡。在诊断检测过程中,HA可结合多种类型的无关抗原,从而干扰抗原-抗体的特异性结合反应,如一个干扰抗体分子分别与固相抗体及标记抗体结合,尽管样本中没有待测抗原的存在,标记抗体通过干扰抗体连接到固相抗体,在洗涤过程中不会被洗去,因此产生了相应的信号,造成假阳性结果;或干扰抗体分别与固相抗体及标记抗体结合,占据固相抗体与标记抗体上的特异性结合位点,使待测抗原无法结合到位点上,无法形成固相抗体-待测抗原-标记抗体复合物,在洗涤过程中,因标记抗体未能通过待测抗原连接到固相抗体而被洗去,造成无法产生相应的信号,造成假阴性结果,如图2所示。

 RF可以与人自身的免疫球蛋白结合,同时也可以与动物的免疫球蛋白交叉反应,从而产生和HA干扰类似的RF干扰。

为解决这一问题,要求在体外诊断试剂研发生产过程中,需要在检测样本的过程中使用其他的阻断剂以防止内源性干扰物质与检测试剂组分抗体结合,避免反应过程中出现的干扰。

    能够阻断检测过程中出现的干扰的阻断剂分为主动阻断剂和被动阻断剂。被动阻断剂主要包括常用动物的IgG,其工作原理是通过与干扰抗体结合,以提供可选结合位点来检测抗体,见图3。一类动物IgG(如羊IgG)只能封闭一种类型的干扰物质(如人抗羊抗体),因此通常选用不止一种类型的IgG。

在鼠双抗夹心法试验中,需要使用特异性阻断剂来去除特定的异嗜性抗体HA干扰,异噬性抗体HA主要包括人抗鼠抗体(HAMA)和类风湿因子(RF)的干扰,这个过程中使用的特异性阻断剂就是我们通常所说的主动阻断剂。这一类阻断剂能够特异性识别抗体的Fab段位点并进行封闭,使干扰抗体无法与待测抗原抗体或试剂中的抗原抗体反应,避免检测结果受到干扰。

在实际使用过程中,主动阻断剂的用量通常小于被动阻断剂,主要为了减少使用过多被动阻断剂导至的信号减小等副作用。

       双抗原夹心法检测抗体的原理与双抗体夹心法类似,特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗原;加入待测样本,孵育使样本中的抗原与固相抗体充分反应,形成固相抗原-抗体复合物,洗涤除去未结合物质;加入标记特异性抗原并孵育,是标记抗原与固相抗原-抗体复合物结合,形成固相抗原-抗体-标记抗原复合物(双抗原夹心),洗涤除去未结合的标记抗原,加入反应物质,判读结果。


  • 间接法

        间接法仅能检测抗体,是检测抗体常用的方法。间接法的基本原理是,将特异性抗原包被在固相载体上,加入待测样本,使待测样本与固相载体上的抗原结合,形成固相抗原-受测抗体复合物;孵育洗涤后,加入标记抗体,标记抗体是针对待测抗体的抗体,通常为羊抗人IgG,它能够与受测抗体的Fc段结合,形成固相抗原-受测抗体-标记抗体复合物;孵育洗涤洗去未结合的标记抗体。过程如图5所示。

通常,间接法使用的标记抗体仅针对一类免疫球蛋白分子,通常采用的是抗人IgG,严格来说,所测仅包括抗体的IgG类,不涉及其他种类抗体。在这种情况下,间接法的检测各类IgG抗体时所用的标记抗体是通用的[1],成本较低。

间接法检测IgG容易受到样本中较高浓度的非特异性IgG干扰,因此通常待测样本需要进行稀释,或使用阻断剂以避免干扰抗体的影响。

尽管通常情况下,间接法仅用于检测IgG,但利用IgG吸附剂清除样本中的IgG抗体后,间接法也可用于检测IgM抗体;采用不同标记抗体时,可同时检测IgG与IgM抗体。


  • 竞争法

竞争法可检测抗体,也可检测抗原。

在抗原检测中,主要用于小分子抗原或半抗原(如药物、激素等)的检测,大分子抗原通常采用夹心法检测。因小分子抗原或半抗原只有一个抗原决定簇,无法采用夹心法。

竞争法的基本原理是先将抗小分子抗原的特异性抗体包被在固相载体上,然后同时加入待测样本与标记小分子,待测样本中的小分子与标记小分子竞争与固相抗体相结合,温浴一定时间后洗涤,根据不同的方法学,加入不同的反应物质(如酶促底物、碱性溶液、氧化剂等),得到反应信号;读取信号,根据预先设定的COV或标准曲线,进行定性或定量的结果判读,过程如图6所示。

竞争法的主要特点是,其反应信号强度与样本中待测小分子的含量负相关。采用竞争法时需注意,标记小分子与受测小分子与固相抗体结合的能力应该相当,以避免不公平竞争而产生的假阴性或假阳性结果。在竞争法反应体系中,固相抗体和标记抗原的量是固定的,且前者的结合位点少于标记抗原与受测抗原的总量,因此能够由结合后的信号强度说明样本中受测抗原与标记抗原含量的比例。

竞争法检测抗体的原理与检测抗原类似。其中,抗原与固相载体的连接,可直接进行,也可通过特异性抗体进行间接固相化,如抗-HBe常用的检测体系中,先将抗-HBe包被在固相载体上,同时加入待测样本和中和抗原HBeAg,此时待测样本中的抗-HBe和固相抗体竞争结合中和抗原HBeAg。因此,待测样本中抗-HBe浓度越高,与固相抗体结合的中和抗原越少。孵育后洗涤,加入标记的特异性抗体,再进行孵育使之与已结合在固相抗体上的中和抗原相结合,形成固相抗体-中和抗原-标记抗体复合物。

        竞争法易受到外界条件变化的干扰,如直接竞争易受到加样本与竞争抗体(抗原)的间隔时间影响[3];样本中的内源性抗体影响;溶血、脂血、RF等影响[4]。在操作过程中需特别注意按要求进行实验。


  • 捕获法

        捕获法又称反向间接法,可测定血清中某种特定的免疫球蛋白,目前主要用于IgM抗体的检测。由于血清中大量的IgG会感染IgM的测定,通常包被的固相抗体为针对IgM分子μ链的抗体,加入待测样本后,特异及非特异的IgM抗体都会被固相抗体捕获,之后加入能够与特异性抗体结合的已知抗原,再加入能够与已知抗原相结合的标记抗体。如图7所示。通常,相比于间接法,捕获法检测血清样本中的IgM抗体灵敏度更高[5]。

        捕获法易受到非特异性IgM及RF(IgM类)的干扰。RF(IgM类)可结合到固相抗体上,再与标记抗体发生反应,从而造成假阳性结果,非特异性IgM抗体与固相抗体结合后,会影响试剂的灵敏度,血清中大量的IgG抗体也会影响检测。为增加灵敏度,可在试剂中添加IgG吸附剂,即纯化后的羊抗人-IgG Fc片段,这样能够在检测前去除血清中的IgG抗体及RF。IgM检测过程中,通常还会对样本进行稀释,减少干扰,提高灵敏度,如图8所示。

参考文献:

  1. 1.       王兰兰等, 临床免疫学与检验. 北京:人民卫生出版社, 2008:103-107

  2. 2.       宋海波等, 中国体外诊断产业发展蓝皮书(2016年第二卷). 2017:178-182

  3. 3.       吴淑梅等, 竞争抑制法检测抗-HBc总抗体的影响因素及对策, [J].检验医学, 2006, 21(4):376-379

  4. 4.       谭立明, ELISA法检测的影响因素及其对策, [J].实验与检验医学, 2013,31(4):300-305

  5. 5.       Paweska JT, Burt FJ, et al, IgG-sandwich and IgM-capture enzyme-linkedimmunosorbent assay for the detection of antibody to Rift Valley fever virus indomestic ruminants.[J].Virol Methods. 2003 Nov;113(2):103-12.


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