基于CTC和ctDNA 的液体活检技术

近年来，液体活检作为一种便捷、微创、动态反映肿瘤基因信息的方法，备受瞩目。通常而言，液体活检主要包含循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTC）和外泌体（exosome），其中CTC是由实体瘤或转移灶释放的，进入外周血循环的肿瘤细胞，侧重于细胞病理诊断，适用于化疗效果监测；ctDNA是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA片段，侧重肿瘤基因层面，其主要反映的是肿瘤的基因突变信息，更适用于靶向药物治疗；而Exosome来源广泛，淋巴细胞、树突状细胞、肥大细胞及上皮细胞、肿瘤细胞等都可以分泌外泌体，其内含物包含过度表达的特异性的蛋白标志物，还含有大量的miRNA、cirRNA和DNA片段等，其所包含的生物学信息非常丰富。

相比较于传统的肿瘤诊断手段，液态活检的优势在于其能解决精准医疗的痛点，因为液体活检的标的物无论是ctDNA还是CTC抑或是exosome均来源于肿瘤组织细胞的凋亡、坏死或分泌，携带基因变异信息，且与肿瘤原发或继发部位具有高度一致性。所以，通过非侵入性取样即可获得疾病的实时信息，从而做到个体化治疗。因此，液态活检理论上在肿瘤的诊断、预后风险评估、治疗方案选择和疾病监测等方面均具有潜在的应用价值。

目前液体活检主要应用领域是肿瘤的血液学检测。其中格诺生物开发的CTC检测试剂盒在2016年2月获得CFDA的III类医疗器械批准，用于肺癌的诊断和病情监控，成为国内第一家把CTC检测推向临床的企业。而利用ctDNA开展肺癌的靶向用药监控也在近年来写进肺癌诊断指南，这其中就包括了罗氏的cobasEGFR突变检测试剂盒v2。cobasEGFR 突变检测试剂盒v2 这是一款以血液为基础的、用于抗癌药特罗凯的伴随诊断试剂盒，采用cobasEGFR Mutation Test v2 对患者血液样本中存在的特定NSCLC突变进行检测，帮助患者从特罗凯治疗中受益。这是FDA批准的首个以血液为基础、用于检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者表皮生长因子受体（EGFR）基因突变的基因检测试剂盒。据统计，这类突变存在于10-20%的NSCLC病例。

ctDNA除在肺癌检测中的辅助诊断之外，还可以检测超过75%的晚期胰腺癌，卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌以及头颈癌等。《ScienceTranslational Medicine》发表的一项多样本的研究报告中也显示可以在大约40%至70%的癌症中检测到循环肿瘤DNA，包括脑瘤、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌等，根据多项研究结果我们可以看出ctDNA在绝大多数肿瘤疾病中均有发生，对肿瘤的发生具有重要提示作用。

在临床工作中，通过检测它是否携带有肿瘤特异性的突变，或其它相关基因组的改变信息就可以判断肿瘤类型，而不会出现假阳性等干扰现象。常用ctDNA的检测分析方法包括定量PCR，微滴数字式PCR（DropletDigital PCR, ddPCR），BEAMing（beads,emulsion, amplification, magnetics）以及NGS相关的标记扩增深度测序方法（Tagged-amplicondeep sequencing, TAm-seq），全基因组测序，全外显子测序等。上述基因检测方法可以对ctDNA进行分析，例如检测基因突变、缺失、插入、融合、重排等；还可以对富集到的ctDNA的浓度进行定量，不论是对ctDNA进行定性还是定量均可以反映肿瘤的类型和严重程度。

目前随着二代测序技术NGS的不断发展，对ctDNA的监测分析已越来越多地应用于各种肿瘤的检测之中，诸如对非小细胞肺癌、乳腺癌和胰腺癌等。在过去的十年中，人们对非小细胞肺癌的看法发生了重要的改变。现代医学认为，针对NSCLC的个体化治疗，应该是利用与这些分子亚型相对应的靶向疗法。诸如利用基于NGS的ctDNA技术，从患者血液中富集ctDNA对其进行检测可以获得BRAF，KRAS，HER2，PIK3CA等相关基因的突变信息，从而根据基因突变情况选择合适的基因靶向药物，有针对性的进行治疗。在一项关于胰腺癌的研究中，EricA分析了26名患者肿瘤中的54个基因，其中90.3%的肿瘤突变都能够在ctDNA中发现，而且其准确率、灵敏度和特异性均非常高。所以，可以通过ctDNA测序的方法，来确定患者的肿瘤基因型，从而为患者提供精准的个体化治疗。

作为一项新技术，液体活检固然具有无可比拟的优势，但如何开发出一套成熟、稳定的检测方法并将其推广开来却是一个极大的挑战。因为无论是CTC还是ctDNA在人体血液中的存量都是极其微量的。所以摆在研究人员面前的第一个难题就是如何高效地获得目标物质。针对CTC的捕获已经开发出了CanpatrolTM，MGIEASYCELLTM，CellSearch, HBCTC-Chip, Mag Sweep等系统方法，然而其特异性和灵敏度尚无法满足临床应用需求。ctDNA在血液中微量存在且不稳。与组织活检相比，利用血液检测EGFR的检出率只有62-65.7%，而KRAS的检出率更低，只有25%-41%。提高检测灵敏度和特异性显然是解决当前液体活检的关键所在。目前市面上的分子诊断试剂灵敏度多以1%为界，当肿瘤突变率低于1%的情况下，现有的检测方法（ARMS-PCR,ddPCR，NGS）的检出率均远远低于组织。所以，液体活检的大范围临床推广尚有待时日，好在我们已经在路上。