FISH 技术在病理诊断中的应用

重现性肿瘤特异性染色体易位及新的融合癌基因的鉴定，在肿瘤的诊断、治疗及预后方面有着重要意义。近十年来，荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization ,FISH）在遗传医学及病理诊断实践中的应用呈快速增长态势。

不同于传统核型分析的是，FISH可以对常规福尔马林固定、石蜡包埋（formalin-fixed, paraffin-embedded， FFPE）的组织细胞进行快速（分子）遗传学分析。

原位杂交技术最初（二十世纪60年代后期）是以放射性同位素来标记探针，之后再进行放射自显影。直到80年代早期，探针才开始用荧光来标记。荧光显微镜及数字成像的进步，以及大量可利用的基因组和生物信息学资源，极大地提高了FISH技术的分辨率、灵敏度、特异性和实用性。

FISH可以检测的遗传学改变有染色体或基因的缺失、易位、获得、扩增和染色体多体。随着越来越多的肿瘤诊断、鉴别诊断和治疗决策是基于FISH的结果，该技术已成为广泛应用的临床工具。本文将主要介绍病理诊断实践中，染色体易位检测的临床应用及策略。

染色体易位是指非同源性染色体之间的重排。易位可以是没有遗传物质丢失或获得的平衡性易位，也可以是伴有遗传物质丢失或获得的非平衡性易位。易位常可导至新的融合基因产生，而这些融合基因可做为一个嵌合性癌基因，通过过表达或破坏重要的表达调控区而使调控因子不反应，从而导至肿瘤的发生。

大约30%的肉瘤中存在染色体易位。大多数肉瘤染色体易位形成的融合基因，其5’端片段贡献强启动子，3’端原癌基因片段可因激活而过表达。大部分融合基因与特定肿瘤类型有关，一些融合蛋白可以作为治疗靶点，故融合基因的检测在诊断和治疗上具有重要价值。

软组织肉瘤中已发现超过400种染色体易位。目前所面临的挑战是，鉴定出真正对于肉瘤具有诊断及治疗意义的易位。基于肿瘤特异性融合基因的FISH分析，30多种亚型的间叶性肿瘤可被确认，其中包括：尤文肉瘤/原始神经外胚层肿瘤、滑膜肉瘤、脂肪肉瘤、圆形细胞尤文样肉瘤、肺粘液样肉瘤及炎性肌纤维母细胞瘤等。

图1.断裂探针：标记于同一基因断裂点的两端，如发生易位，则产生断裂信号

图2. 融合探针： 标记两个不同基因，如二者发生易位，则产生融合信号

尤文肉瘤是由具有高度恶性行为的小圆蓝细胞组成，通常累及儿童和青年人的骨骼和骨外组织。在大多数尤文肉瘤中，存在一个特异性的染色体平衡易位，可以用于尤文肉瘤的鉴别诊断。

EWSR1的融合伙伴来自于编码转录因子多个基因家族。这些融合蛋白包含EWSR1的氨基末端和一个ETS基因家族成员的羧基末端。多达90%的易位涉及到EWSR1基因的形式为t(11;22) (q24;q12)易位，将EWSR1置于22q12与11q24的FLI1基因并列。10%的尤文肉瘤涉及到ERG易位t(21;22) (q22;q12)，产生EWSR1-ERG融合。

任何有着黏液样改变的软组织肿瘤都与黏液样脂肪肉瘤相似，因此单独依靠组织学诊断黏液样脂肪肉瘤是一个挑战，特别是对于小的穿刺标本。

在成人肉瘤中，黏液样脂肪肉瘤大约占10%，在脂肪瘤中大约占33%。黏液样脂肪肉瘤的特异性染色体易位主要有t(12,16)(q13;p11)和t(12;22)(q13;q12)，导至DDIT3与FUS或EWSR1产生融合基因。超过95%的黏液样脂肪肉瘤中包含上述融合基因中的一个。黏液样脂肪肉瘤鉴别诊断中，常用的FISH探针是DDIT3双色分离探针。

滑膜肉瘤的特异性易位为t(X;18)(p11;q11)，涉及18号染色体SS18基因及Xp11的SSX1基因（66%）或SSX2基因（33%）。大约90%的滑膜肉瘤出现t(X;18)(p11;q11)易位，而t（X;18）易位在其他肉瘤中从未发现。因此用FISH技术检测t(X;18)(p11;q11)，对于诊断滑膜肉瘤具有高度敏感性及特异性。

通常认为孤立性纤维瘤源于周皮细胞，但现有证据支持其成纤维细胞或肌纤维母细胞来源。目前在孤立性纤维瘤发现了12q13区域的臂内倒位，产生NAB2-STAT6融合基因。

Mohajeri等利用6种不同的分子生物学技术在41例孤立性纤维瘤患者中检测出37例携带NAB2-STAT6融合。但由于NAB2, STAT6基因在染色体上距离较近，FISH方法不能很好的检测。RNA-seq是一种较好的检测方法，或者STAT6免疫染色敏感性及特异性也可很好的检测NAB2-STAT6融合产物。

有一小部分肉瘤在临床上和组织学上类似尤文肉瘤，但这些肿瘤却没有尤文肉瘤的遗传学异常。在这些“尤文样肉瘤”中发现了t(4;19)(q35;q13)染色体易位，生成CIC-DUX4融合基因。CIC-DUX4利用传统细胞学、RT-PCR,FISH方法都可检测。独特的组织病理学特征和迅速的疾病进展提示需要将此种类型的肉瘤分类为CIC-DUX4易位型肉瘤。

炎性肌纤维母细胞瘤是常见于膀胱的梭形细胞肿瘤，偶尔见于其它部位。此种肿瘤通常表现良性，但却很难同肉瘤或肉瘤样癌区分。大约50%的炎性肌纤维母细胞瘤含有ALK重排，导至过表达ALK蛋白。

ALK重排包含多种伙伴基因，如TPM3、 RANBP2、TPM4、EML4、 CLTC、 CARS-、 ATIC、SEC31A及 PPFIBP1等。在另外 50% ALK重排阴性的炎性肌纤维母细胞瘤中，发现小比例的YWHAE–ROS1 ，ETV6–NTRK3，TFG-ROS1重排。

肺泡软组织肉瘤具有典型的组织病理学特征，但组织起源具有争议性。在大约80%的此种肿瘤中发现ASPSCRI-TFE3 [der(17)t(X;17)(p11;q25)]重排。此重排在具有乳头状结构的肾细胞癌中也有发生。

横纹肌肉瘤是一种侵略性很强的肉瘤，伴有PAX3-FOXO1 [t(2;13)(q35;q14)]或PAX7-FOXO1 [t(1;13)(p36;q14)]易位。利用FOXO1的分离FISH探针即可检测，且较RT-PCR具有更好的敏感性及特异性。

软组织透明细胞肉瘤是一种少见的间质细胞恶性肿瘤，好发于中青年下肢软组织。此肿瘤侵袭性强，局部复发率高，易远端转移。大约90%的此肿瘤含有EWSR1-ATF1易位，6%含有EWSR1-CREB1易位。

原文：Fluorescence in situ hybridization in surgical pathology:principles and applications. J Path: Clin Res April 2017; 3: 73–99