Nature子刊：CTC上多重蛋白质定量分析可以在单细胞水平上实现啦！ ——单细胞蛋白质表 ...

    蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，它可直接作用于体内免疫应答、调节和催化等过程。蛋白标志物的存在及表达水平差异也将直接阐明生物体在生理或病理条件下的变化机制。因此，对蛋白标志物结构、功能和表达量的研究有利于监测疾病的发生和发展情况，指导临床治疗。经典的蛋白质组学研究大多是组织水平上的研究，反映了细胞中蛋白质表达量的平均水平。然而，同种细胞的不同个体间存在着显著的微观不均一性（异质性），基于大量细胞的实验结果难以反映单细胞水平上的生命活动规律[1]。单细胞分析能够避免总体均值导至的信息丢失[2]，反映出单个细胞的重要变异。

单细胞检测技术可以对信号通路蛋白（细胞膜受体，胞浆蛋白，转录因子）进行细致研究，从而对阐明生命的基本规律，研究疾病发生、发展的机理，对疫苗、靶向药物的开发都具有极其重要的意义。因此，基于单细胞的蛋白质研究能在更深的层次上揭示生命活动的本质和规律，从而为探究疾病的起因、发展和治疗提供更为可靠的科学依据。然而，测定单细胞中的蛋白质是一个极大的挑战，因为单细胞中蛋白质含量非常低，平均每个细胞中约含8 ×109 个蛋白质分子，却只含有1万多种蛋白质，某些种类的蛋白质分子甚至小于100个[3]。因此，灵敏的检测技术和先进的分离方法是分析单细胞蛋白质所必需的[4]。近年来，涌现了一系列单细胞蛋白定量检测的方法，包括微流控技术，微孔技术，基于活性的荧光探针技术和质谱技术等。其中微流控技术由于其检测通量高、快速准确、效益高、样本和试剂用量少等特点被广泛采用[5]。

在液体活检领域中，循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell, CTC）在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现已逐渐崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段。继而，CTC单细胞异质性的研究受到广泛的关注。由于外周血中的CTC含量极为稀少，在1mL外周血中含有约1 千万个白细胞和50 亿个红细胞，而仅含有数个CTC[6]。先对血液中的CTC进行富集，再对富集的细胞悬液进行CTC单细胞蛋白质研究是目前采用的主要方式。然而，一直因为检测技术不能够很好的满足临床需要，而使CTC异质性的研究停滞不前，影响CTC在肿瘤诊断及治疗中的指导作用。

美国 ProteinSimple 公司2016年推出的单细胞蛋白质表达定量分析系统【rare-cell, single-cell resolution Western Blot ( scWB ) —— Milo】应运而生。Rare-cell scWB可以很好的解决上述的两大技术难题。Rare-cell scWB是第一款单细胞水平，蛋白质表达定量分析系统。由美国加州大学伯克利分校，生物工程系Amy E. Herr教授实验室研发。该系统在一次普通的抽血（2―4mL血液）中，可以捕获到血样中极为稀少的CTC，并对其蛋白质表达水平进行分析，以检测其中与癌症相关的蛋白质。ProteinSimple的市场总监Kelly Gardner对rare-cell scWB（Milo）描述：传统Western不能体现细胞异质性，而Milo可以。该原创性技术连续发表了包括《Nature method》[7]， 《Nature Protocol》[8]和《PNAS》[9]在内的一系列顶级杂志。并且当选The Scientist Magazine 评选的“Top10 Innovations 2016 ”的TOP1。

图：Milo单细胞蛋白质表达定量分析系统

单细胞蛋白质表达定量分析系统（rare-cell scWB）用于检测CTC的具体工作流程为（详见图1）：①使用Vortex HT chip[10]从2-4mL全血中富集细胞（CTC）；②将收集到的细胞悬液（300uL）直接加入scWB 微流控装置上，对CTC细胞核进行Hoescht 33342染色，便可以通过显微镜观察到每一个CTC被单独收集到每一个直径为50um的微孔中；③原位裂解细胞，释放蛋白，进行蛋白质电泳，将不同分子量蛋白进行分离。蛋白分离后，进行原位蛋白捕获，将分离好蛋白原位捕获在独特的水性分离胶中使用Western Blot验证抗体及荧光标记二抗直接杂交；④扫描仪进行芯片扫描后，Scout软件对扫描结果进行深度定量分析。

表1：单细胞蛋白质表达定量分析系统（rare-cell scWB）工作流程[11] 

Dr. Herr及其研究团队在健康人血液中分别加入三种不同的乳腺癌亚型肿瘤细胞：TNBC(BT-20) ；ER+ (MCF7) ；HER2+ (SK-BR-3)，用白细胞和空白作为对照组，分别用三台设备进行检验。排除不同设备间的差异后，实验结果显示，rare-cell scWB不仅可以捕获单独的CTC，而且可以捕获到和其他细胞结合了的CTC[11]。证实了rare-cell scWB分析系统的捕获能力毋庸置疑。并且，rare-cell scWB可用于检测大量含有CTC和CTC含量稀少的个体。Rare-cell scWB分析系统符合当前临床的检测需求。

Rare-cell scWB分析系统在微流控单细胞采集孔中，原位蛋白裂解后直接进行蛋白质电泳，避免了传统蛋白抽提方法引起的样本丢失，并通过原位蛋白质捕获，无需转膜，避免传统Western转膜造成的蛋白丢失。通过蛋白质电泳，可将不同分子量蛋白质分离，当有非特异性结合时，可以通过蛋白大小，分辨特异信号，准确的进行特异靶蛋白信号定量，避免传统技术导至的非特异性信号。在蛋白质杂交过程中，单次可以进行四个靶蛋白检测，通过洗脱再杂交，单个细胞可以进行多达12种靶蛋白检测（详见表2）。且蛋白分离后的芯片，可以保存长达9个月，从而最大程度的保护稀缺的样本，便于后续进行更多的研究。

表2：单细胞蛋白质表达定量分析系统（rare-cell scWB）检测的蛋白种类

在肿瘤研究的过程中发现，肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，这种肿瘤异质性使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异[12]。人类要攻克癌症，需要对其异质性进行深入研究[13]。然而，由于外周血中CTC 含量极为稀少，CTC单细胞体积微小，加之CTC含有的蛋白质种类繁多、相对分子质量大、组成复杂且含量极低，导至CTC单细胞蛋白定量检测存在极大的难度。单细胞蛋白质表达定量分析系统（rare-cell scWB）对CTC在单细胞水平上进行多重蛋白质分析，将在肿瘤诊断、治疗和监控等方面进一步取得进展。对于肿瘤生物标志物的发现，肿瘤药物研究等具有使用价值的应用具有重要意义。

今后，关于CTC单细胞蛋白质定量检测方法的研究将继续以高灵敏度、高特异性、多重检测为目标不断发展，为人类健康作出更多贡献。

参考文献：

[1] Carlo D and Lee P. Dynamic single-cell analysis for quantitative biology [J]. Analytical Chemistry, 2006, 78 (23): 7918-7925.

[2] Mu X, Zheng W, Sun J, et al. Microfluidics for manipulating cells [J]. Small, 2013, 9 (1): 9-21.

[3] Sims C E and Allbritton N L. Analysis of single mammalian cells on-chip [J]. Lab on a Chip, 2007, 7(4): 423-440.

[4] Borland LM, Kottegoda S, Phillips KS, et al. Chemical analysis of single cells [J]. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif), 2008, 1: 191-227.

[5] Wei W, Shin YS, Ma C, et al. Microchip platforms for multiplex single-cell functional proteomics with applications to immunology and cancer research [J]. Genome Med, 2013, 5(8): 75-86.

[6] Paterlinibrechot P and Benali NL, Circulating tumor cells (CTC) detection: Clinical impact and future directions [J] Cancer Letters, 2007, 253(2):180-204.

[7] Hughes A J, Spellke D P, Xu Z, et al. Single-cell western blotting [J]. Nature methods, 2014, 11, 749-755.

[8] Kang C, Yamauchi K A, Vlassakis J, et al. Single cell-resolution western blotting [J]. Nature protocols, 2016, 11(8): 1508-1530.

[9] Hughes A J and Herr A E. Microfluidic Western blotting [J]. PNAS, 2012, 109(52): 21450-21455.

[10] Nagrath S, Sequist L, Maheswaran S, et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology [J]. Nature, 2007, 450(7173): 1235-1239.

[11] Sinkala E, Christen E, Renier C, et al. Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting [J]. Nation Communications, 2017, 8(14622): 1-12.

[12] Hanahan D and Weinberg R A. Hallmarks of cancer the next generation [J]. Journal of Cell, 2011, 144(5): 646-674.

[13] Gerlinger M, M D, Rowan A J, et al. Intratumor Heterogeneity and Branched Evolution Revealed by Multiregion Sequencing [J]. New England Journal of Medicine, 2012, 366(10): 883-892. 

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