三代明星：PacBio及其序列数据

再来看看江湖呼声渐涨的三代测序技术。目前三代测序市场上，表现最为抢眼的莫过于以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies为代表的纳米孔单分子测序技术。与前两代相比，三代测序最为核心的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。

PacBio SMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。测序时，不需要对目标DNA进行PCR扩增，而是直接在目标片段两端加上两个发卡结构的接头，形成一个连续的环状结构。也因此，PacBio系统在读长上显示了极大的优势。目前比较受市场热捧的三代测序是PacBio的RSⅡ和2015年推出的Sequel。

PacBio下机产生的序列文件以HDF5格式存储。可以采用h5dump命令来查看H5文件内容。

1. 查看碱基序列：

h5dump –d /PulseData/BaseCalls/Basecall raw.h5 > Basecall.info ,文件内容如下：

DATA {(0): 67, 71,67, 67, 65, 71, 67, 71, 65, 65, 84, 71, 71, 67, 84, 71, 67, (17): 71, 71, 71,71, 65, 65, 71, 67, 65, 71, 65, 65, 65, 84, 84, 65, 84, (34): 67, 67, 71, 84,65, 65, 65, 67, 84, 71, 84, 84, 71, 67, 84, 71, 67,

该文件采用的ASCII码的编码方式存储的碱基序列：A=> 65, C=>67, G=>71, T=>84。

2. 查看碱基质量值：

h5dump -d /PulseData/BaseCalls/QualityValue raw.h5 > Basecall.quality,

文件内容如下,其碱基质量值采用与illumina技术一致：

DATA {(0): 51, 44,42, 44, 24, 24, 51, 51, 51, 51, 50, 20, 20, 20, 50, 51, 51, (17): 48, 48, 48,47, 9, 9, 9, 51, 51, 46, 31, 31, 31, 31, 44, 51, 51, 30, (35): 30, 51, 51, 7,7, 7, 7, 51, 51, 44, 44, 44, 51, 51, 50, 27, 27, 26,

长到天际：Nanopore及其序列数据

Oxford Nanopore 公司2005年在英国牛津成立，其运用的纳米孔测序技术使得DNA链在一个单通道中就能够被解码和识别，而不需要将长链打断成小短链。由于实现了DNA聚合酶内在自身的延续性和反应速度，Nanopore读长更长速度更快；同时由于能直接检测每个碱基的特征性电流，因而能对修饰碱基进行测序，对于表观遗传学研究具有极高的价值；因此，这款长到天际的测序仪，非常有潜力横扫当前测序格局。

2014年春天推出U盘大小的便携式MinION测序仪，仪器售价仅需$1000，据官网报道最长Reads可长达960 Kb，2014年10月推出平板大小的台式测序仪PromethION，有48个flow cell，可以单独运行也可以并行，2017年推出桌面式GridION X5测序仪。

Nanopore目前还主要在测试和生产阶段，尚未大规模应用，其应用主要体现在微生物等小基因组生物上。推出至今，其最亮眼的表现莫过于2014年西非埃博拉病毒爆发，MinION以最快的速度破译病毒序列，名噪一时。随着独特的纳米孔技术的成熟和完善，未来在即时检测、太空应用、大众检测等方面会有很大的想象空间。

Nanopore测序得到的序列文件的格式基础也是HDF5（https://support.hdfgroup.org/HDF5/），下机产生后缀为Fast5的序列文档。Fast5文件可经由Poretools软件（http://poretools.readthedocs.io/en/latest/）转换为Fastq文件或Fasta，然后进行后续数据分析。

① 应用Poretools将fast5转换为fastq，示例见：

http://poretools.readthedocs.io/en/latest/content/examples.html#poretools-fastq

② 应用Poretools将fast5转换为fasta，示例见：

http://poretools.readthedocs.io/en/latest/content/examples.html#poretools-fasta

总结一下，在测序市场中，一代测序因其准确度高，仍作为突变检测、单菌鉴定等的金标准而存在；以illumina HiSeq和MiSeq为代表的二代测序势头强劲，主打低成本和高通量，2017新机型NovaSeq更宣称已将测序成本降至百美金；科研市场上三代测序最常见的莫过于PacBio，辅以冉冉上升的新星Nanopore等，主打长读长策略，直击二代测序碎片化序列的软肋，在基因组de novo上表现不俗，错误率较高，但可被矫正。

回到我们今天的主题---数据格式上，一代测序主要是读取峰图文件后转化为Fasta格式；二代测序中illumina原始读取数据为BCL，下游分析中转化为Fastq格式；454下机序列为SFF格式，后续分析中转化为Fna-Qual格式使用；Ion Torrent下机序列为WELLS格式，下游分析中转化为Bam格式；三代测序的两大主流系统PacBio和Nanopore，其下机数据都以HDF5格式为基础，后续转化为Fastq格式进行下游分析。

不管一代、二代还是三代的数据分析中，原始下机数据都以二进制文件为主，原因无他，相比于文本文件，二进制文件在存储上更为经济集约。二进制文件本身是难于阅读的，并且很难改动，所以，我们可以乐观的认为，二进制文件造假的可能性是很低的。二进制的数据拿到之后，我们想要把数据转换成正常人能看懂的格式，这时身为文本文件的Fastq就应运而生了，Fastq文件会被用于质控及比对等后续分析。

总之，Fastq是当前最为主流认可的序列数据存储格式，不管哪一代测序技术，什么样的原始数据，都免不了要打上Fastq格式的烙印，Fastq文件的格式及使用已经成为高通量测序学习中当仁不让的第一站。