液体活检：收集肿瘤特异的指纹

最理想的情况是，研究人员能通过简单的血液检测来实现组织活检的敏感性和特异性。如今，液体活检的出现，让这一切成为可能。

液体活检

据斯坦福大学医学院的助理教授Max Diehn介绍，就传统的癌症标志物而言，普遍的问题是特异性。“对于之前探索的大多数生物标志物，正常细胞也会产生，因此并不是肿瘤细胞所独有的。这意味着，它们往往不是很特异。”液体活检则通过搜索血液及其他体液中更加特异的肿瘤指纹，来克服这方面的缺陷。

这些指纹有两种形式。循环肿瘤细胞（CTC）是从肿瘤上脱落的活细胞，可能代表了转移的种子；循环肿瘤DNA（ctDNA）则是来自死细胞的遗传物质，通常以DNA短片段的形式存在。Diehn实验室最近介绍了一种检测非小细胞肺癌患者血液中的ctDNA的方法，这些片段的平均长度为170 bp 1。

当然，正常细胞也存在于血液中，而且每天都有正常细胞死亡。因此，无论研究人员是寻找CTC还是ctDNA，他们都必须慧眼识珠。对于CTC，这通常是借助细胞表型来实现的，如利用Janssen Diagnostics的CELLSEARCH分析，它根据上皮细胞标志物的表达来选择细胞。

对于ctDNA，研究人员必须根据它们的序列来挑出片段，这是个艰巨的任务，因为没突变的DNA不能提供信息。因此，这项技术适用于突变已知的情况。例如，Diehn开始鉴定NSCLC患者中常常突变的基因组区域，生成CAPP-Seq selector文库。这个寡核苷酸集合代表了139个基因的521个外显子和13个内含子。研究小组利用它来收集血浆中的互补DNA片段，并以高覆盖度测序。

根据2014年约翰霍普金斯大学医学院的研究，ctDNA可在各类肿瘤患者的血浆或血清中发现，不过随着肿瘤位置和分期的不同，分析的敏感性也有差异。“75%的晚期胰腺癌、卵巢癌、大肠癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌等癌症患者中可检测到ctDNA，不过对于原发性脑癌、肾癌、前列腺癌或甲状腺癌，检测率不到50%，”作者写道2。

约翰霍普金斯大学的肿瘤学教授Nickolas Papadopoulos表示，研究人员可以通过靠近源头来实现更高的敏感性，比如，在检查泌尿生殖系统肿瘤时检测尿液，或在检查头颈部癌症时检测唾液。实际上，研究小组最近发现通过脑脊液检查，使得中枢神经系统的肿瘤检测有所改善3。

如同许多ctDNA研究一样，霍普金斯的团队也使用靶向测序来检测ctDNA。在这种情况下，一种称为Safe-SeqS的条形码策略可准确报告样本中的ctDNA分子数量。研究人员也可以利用数字PCR来定量具体的变化，不过有的作者指出，“数字PCR分析提供了高的准确性和灵敏度，但需要个性化分析的设计，这是限速步骤”4。

有利有弊

研究人员检测癌症患者的血液及其他体液中的ctDNA，使其成为一种有潜力的生物标志物。然而，据Papadopoulos介绍，ctDNA不仅仅是指标，似乎还与“肿瘤负荷”有关，其水平随疾病严重程度而升高。此外，一些早期的癌症也能检测到ctDNA，表明不仅可使用ctDNA来监控现有的癌症，还能作为筛查工具。

美国国家癌症研究所淋巴治疗科的科长Wyndham Wilson表示，ctDNA还能用于预测肿瘤的复发。在一项弥漫性大B细胞淋巴瘤的研究中5，ctDNA能够在CT扫描前几个月就发现肿瘤复发。因此，医生能够更早治疗患者，改善他们的长期预后。

然而，ctDNA作为筛查工具，也面临一些潜在的问题。目前还不清楚ctDNA在不同的癌症类型、分期和患者中的普遍程度。即使检测到ctDNA，也不清楚是体内哪里产生的，或者即使检测到的突变与肿瘤存在一定关联，也需要后续检测。

相比之下，CTC分析能提供基因组完整的活细胞。因此，研究人员可分离出这些细胞，在显微镜下观察它们，并研究每个细胞的基因组和蛋白表达。Aviva Biosciences公司的研发副总裁Antonio Guia认为，这带来了比ctDNA分析更广谱的方法，因此你不必看特定基因的特定片段。

最近，哈佛大学的Daniel Haber及其同事就开展了一些研究，利用单细胞RNA-Seq来鉴定单个前列腺癌CTC的信号差异，并将这些差异与治疗反应相关联6。研究小组利用一种称为CTC-iChip的微流体设备来分离CTC，它根据CD45或CD66的表达将CTC与其他血细胞分离。

不过，对于液体活检而言，问题并不在于选择CTC还是ctDNA。Janssen Diagnostics的首席医疗官Jorge Villacian认为，两种标志物能提供互补的信息，作为临床工具都有市场。这家公司专注于CTC诊断。

“肿瘤医生以及监管部门对液体活检的概念了解得越多，对每个人都是双赢的 – 对患者、对医生以及对制度本身，因为这将使得发病率更低、并发症更少，并改变早期治疗，对患者有利。”