液体活检的重要一环，不容忽视的“游离核酸采血管”！

近年来，随着测序技术的高速发展以及国家一系列利好政策的推动，以血浆中的游离DNA(cell free DNA,cfDNA)为研究对象的无创产前诊断和肿瘤液体活检产业蓬勃发展。由于血浆内胎儿DNA和循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)含量较低，低频突变或超低频突变的检测仍困难重重。

在母亲血浆中，单胎妊娠早期的胎儿释放的游离cfDNA浓度小于10%(1)。随着保存时间的延长，白细胞降解及随之而来的母体基因组DNA(gDNA)的释放将严重影响低含量的胎儿DNA的比例及完整性。对于循环肿瘤DNA而言，这一问题更为突出。在癌症早期，突变等位基因的频率(mutant allele frequencies,MAFs)可能低至1/10,000(2)。cfDNA样本本身在保存过程中如果被“背景”gDNA干扰，会造成检测灵敏度的大幅度降低以及大量数据的浪费。因此如何稳定血浆中的白细胞，降低其在保存过程中因降解而释放大量gDNA造成的“污染”，是液体活检的重要一环。

图1. 怀孕母亲和肿瘤病人的cfDNA分别包含来自胎儿和肿瘤的有效信息。通过采集，分离，提取和分析血浆中的cfDNA有助于实现对胎儿和肿瘤的检测与诊断

对于cfDNA的保存，利用超高速离心分离血浆是最直接有效的避免白细胞gDNA干扰的方法。但是实际样品采集中，往往不具备高速离心和冷冻保存的条件。游离核酸采血管便在这种情况下应运而生。这些保存管的目的就是尽可能长时间的在常温状态下保存血浆中的游离核酸。目前商业化的游离核酸采血管，有些利用甲醛等交联剂稳定白细胞减缓背景gDNA的释放。但是这些交联剂会损伤cfDNA，并且会降低测序检出率。

最近，我们了解到一个名为ProTeck® (CFGenome, LLC, Denver, CO)的游离核酸采血管，ProTeck®游离核酸采血管是来自美国CFGenome®公司的最新研发产品。针对游离核酸保存痛点，ProTeck®采血管利用蛋白酶抑制剂和代谢酶抑制剂稳定白细胞，减少其裂解引起的gDNA对cfDNA的污染。

ProTeck®游离核酸采血管容量为10 mL，内含300 μL特有的cfDNA稳定剂，用于抑制血细胞的代谢。与市场的同类产品相比，保存时间长达28天。血浆样品收集到ProTeck®采血管中，即刻便可抑制血细胞的代谢活动，减少gDNA释放。如图2可见，28天内ProTeck®采血管里的cfDNA的整体含量稳定；而在K₃EDTA采血管(BD vacutainer®,Becton Dickinson,Franklin Lakes, NJ)中，cfDNA的总量则随着时间推移则有显著增加，原因在于白细胞裂解，释放了大量背景噪音的gDNA片段。

图2.血浆cfDNA总量在28天保存期内的变化。ProTeck®采血管有效抑制了背景gDNA释放对cfDNA总含量的影响。来源：CFGenome®Time Stability测试数据

基于对背景DNA的有效抑制，ProTeck®采血管对于ctDNA的突变检出表现优秀。图3显示，KRAS野生型基因在K₃EDTA采血管中随着时间推移背景干扰逐渐增加，导至低频突变被噪音gDNA淹没。

图3. 血浆cfDNA中KRAS野生型基因的在K₃EDTA 采血管和ProTeck tube 28天保存期内的拷贝数对比

如表1显示，仅一天后，K₃EDTA采血管中的KRAS基因突变(Exon2,G13D)无法被有效检出。相比之下，保存在ProTeck®采血管中的血浆样本即使28天后仍然可以检出该低频突变。

表1.KRAS基因Exon2的G13D突变在K₃EDTA和ProTeck®采血管28天保存期内的检出结果对比(therasreen KRAS RGQ PCR kit)

由此可见，ProTeck®采血管是集“采样、保存、运输”为一体的新一代游离核酸采血管。其特有的超长期保存和有效抑制背景gDNA污染将进一步解决现有cfDNA样本保存的难点问题，方便了样本储存和运输，简化了临床实验室的运作。其专利独有的新型保存剂能够高效固定血液细胞，避免基因组DNA释放造成对ctDNA的污染，确保低频突变的有效检出。像ProTeck®这类的采血管将有助于从事无创产前诊断和液体活检服务的供应商扩展有效服务半径，同时实现从源头上把控样品质量。

参考文献：

1. Lo YM, Tein MS, Lau TK, Haines CJ, Leung TN, Poon PM, et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for non-invasive prenatal diagnosis. Am J Hum Genet 1998;62:768–75.

2. Thierry AR, Mouliere F, El Messaoudi S, Mollevi C, Lopez-Crapez E, Rolet F, et al. Clinical validation of the detection of KRAS and BRAF mutations from circulating tumor DNA. Nat Med. 2014; 20: 430–5.